水蛭素是由65 ～66个氨基酸组成的小分子单链蛋白，分子量为7000左右。水蛭素肽链中部有一个Pro-Lys-Pro 组成的特殊序列，使其不被一般蛋白酶降解。水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，并能阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等瘀血现象，能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。

重组水蛭素HVZ与天然的HVZ仅63位的酪氨酸有所不同（天然的水蛭素的63位磺酸化形成Tyr-50）,但在决定活性蛋白生理效能的的蛋白二级结构层面，重组水蛭素与天然的水蛭素主要的二级结构完全相同,因此功效没有明显差别。

1. 医学结构功效解析

水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂,最初从水蛭的唾液腺中提取,极其微量；我们运用生物工程重组DNA技术,可产业化制备重组水蛭素。

水蛭素分子呈蝌蚪状,包括两个功能区:含3个二硫键结构紧密的N端核心区域和无规则的C端尾部。N端的核心区域结合于凝血酶的活性位点,而C端尾部则结合于酶对纤维蛋白原的识别位点,它们共同作用,使水蛭素对凝血酶有高度的亲合性和抑制作用,并且两种功能区的片段均有活性。它是迄今为止,世界上最强的凝血酶特效抑制剂。药理学及临床研究表明,水蛭素在防治血栓形成较之肝素钠及其它抗凝剂,有其独特的优点和效果,且无明显副作用。

凝血酶是一种在血栓形成过程中起非常关键作用的丝氨酸蛋白酶。水蛭素不仅可以与血浆中游离 的凝血酶结合 ，还能中和与纤维蛋白结合的凝血酶 ，进而抑制凝血酶上凝血因子 I的结合位点，使凝血酶不能和凝血因子I结合 ，从而抑制凝血酶的促凝作用 ，使凝血过程减慢 ，并且其过程中不需抗凝血酶 Ⅲ或其它辅助因子的协助。

2. 重组水蛭素稳定性

水蛭素是由65个氨基酸残基组成的单链多肽,成蝌蚪状,包括N端核心区域和无规则的C端尾部。水蛭素的稳定性,首先应因于结构紧密的N端核心区,它依靠3个二硫键和反平行的俘折叠形成疏水的蝌蚪头部,高温处理以及pH的变化都不影响其活力。

重组水蛭素的稳定性分析方法:水蛭素(2nmol)溶于40ul(50umol/L)各种不同溶液中,并在不同的温度下处理,在所有的条件下均没有水蛭素沉淀出现,处理的样品,作抗凝血酶活力分析，对照组样品(未经处理的水蛭素)的活力为100%。

3.1温度对重组水蛭素影响

室温下，不添加蛋白保护剂情况下，液体存放六个月稳定性得到完整保持；80℃，加热十分钟活性无改变，95℃加热三分钟活性不丧失；温度对水蛭素的活力几乎没有影响,其水溶液经100℃处理lh,活力仍然达98%。木瓜蛋白酶，胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶会影响其活性，作为日化原料添加请注意配方体系的调整。

3.2pH的变化对水蛭素的影响

水蛭素在不同的pH1—9条件下室温处理2h,其活力基本保持不变。70℃水浴15min后发现,水蛙素的活力在酸性和中性条件时活力不丧失。

碱性条件下其活力有所变化,pH10时,开始丧失部分活性,到pH13,只剩余不到一半的活性。进一步分析pH13的情况,在pH13时以不同的温度处理水蛭素,在80℃时处理15min后活性全部丧失。

我们对极酸性条件下,水蛭素的活性进一步地分析,在pH1,室温存放2h,活力没有明显变化;ph1，100℃水浴15min后稍有降低,但仍达98%;可见水蛭素在酸性条件较为稳定。

只有pH和温度同时升高其活力才开始下降,pH13、80℃处理15min会完全失活,原因分析在于水蛭素单链结构中Cys和Lys被破坏。

试验分析结果进一步显示：重组水蛭素在 4℃和室温条件下放置 12个月 ，其抗凝活性 、外观 、pH 值等均未发生改变；

因此重组水蛭素是稳定性非常高的活性蛋白，作为日化修复护理原料添加物不受限。

3. 重组水蛭素产业化工艺

I. 将构建水蛭素表达基因整合于巴斯德毕赤酵母中，得到水蛭素基因工程菌 。

II. 培养基灭菌，接种发酵生长I酵母（分级发酵）

III. 通过特定诱导I酵母生长，分泌得到重组水蛭素蛋白

IV. 高速离心固液分离

V. 超滤、层析分离纯化（吸附和洗脱）

VI. 膜滤分装

4. 影响水蛭素活性因素

4.1 微生物污染

配方体系若遭受微生物污染，产生的酶可能会导致水蛭素活性丧失。

4.2 pH值影响

适用pH1——9，活性没有明显影响。

4.3 温度影响

常用添加温度对水蛭素活性无明显影响，请放心添加。

5.4光线影响

未见光线对活性稳定性造成明显影响，但请避光保存。

5.5等电点

等电点是pH3.8，使用时请避开pH3.5——4.5环境添加；请不要使体系长时间维持在pH3.8左右，会造成活性蛋白析出，同时可能造成蛋白降解。

第二部分（Section two）

重组水蛭素皮肤运用

1．抗凝化瘀，促进微血管循环

水蛭素与凝血酶的亲和力极强,1μg可中和5μg凝血酶,相应于摩尔数比1：1,即中和一个国际单位(NIH单位)凝血酶的水蛭素量为一个抗凝单位(IAT-u)的水蛭素。

水蛭素不仅能阻止纤维蛋白原的凝固,亦可阻止凝血酶催化的进一步血瘀反应,如对凝血因子Ⅴ、Ⅷ的活化及凝血诱导的血小板反应等的抑制。血液凝固的被推迟或完全被阻止取决于水蛭素的浓度。亦可抑制凝血酶同血小板的结合及血小板受凝血酶刺激的释放,并可使两者解离。

1.1运用优势

目前，在日化护理领域肝素用于抗凝化瘀，促进皮肤微循环较为广泛，然而肝素钠作为皮肤微循环原料有诸多不利，比如抗凝化瘀需要辅助抗凝血酶Ⅲ参与，量效关系不够明确，对血栓的凝血酶没有作用，受PTF4干扰，出血副作用较大。

水蛭素抗凝化瘀时抑制凝血酶的反应不需要抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)作为辅助因子，其抗凝作用与量效关系更吻合，在缺乏抗凝血酶Ⅲ的人体中用不受限；水蛭素则对循环中的和结合于血栓上的凝血酶都可以抑制；肝素会被激活的血小板释放的血小板因子4(PTF4)或富含组氨基酸的糖蛋白等结合，水蛭素则不受这些因素的影响；

在天然水蛭粉中，水蛭素含量太少，其活性低，成分复杂，不明确，外用对肌肤造成麻痹，经皮有刺激性。　　我司生产的重组水蛭素采用人工合成的HV2基因序列构建出适合于酵母表达系统的载体，并转入到毕赤酵母，成功获得了工程菌。表达量占菌体分泌总蛋白的50%以上，纯度＞98%，水蛭素原液活性保持在20000atu/g以上,重组水蛭素用于抗凝化瘀治疗无过敏反应和免疫原性无毒反应。

重组水蛭素其活性是水蛭粉的30倍以上。因重组水蛭素纯度高，无色无味透明，添加不受温度，酸碱等影响，添加量是水蛭粉添加量的三十分之一，因添加量非常小，不影响体系稳定性，无经皮接触刺激。

1.2改善皮肤微血管循环方向

1.2.1 改善眼部血淤，

医学上眼部血淤是因为肌肤微循环不畅造成，表现为眼部黑眼圈、浮肿、色素沉着；眼周血液循环不好引起静脉血积聚，表现出眼周肌肤发暗发青。去黑眼圈从根本上来说要加强血液循环

1.2.1.1测试方法数据：将空白对照品，重组水蛭素、水蛭提取物，配制成凝胶状产品，早晚使用一次，观察对象均是微循环引起的黑眼圈、浮肿；其中黑眼圈14例，浮肿8例。

(-) 表示无明显效果(+) 表示有效果  (++) 表示有明显效果 (+++) 表示有非常明显效果

1.2.1.2功效比较考察

患者情况：睡眠不佳导致的黑眼圈与眼袋，以往使用过多种眼部护理产品，一直改善不明显。两眼的黑眼圈与眼袋严重程度一致，使用重组水蛭素凝胶剂与马应龙眼霜分别使用在左、右眼周，使用28天为一周期，其中7天，14天、21天、28天为观察日。

测试标准：1、黑眼圈比色卡有 1 ～ 10 个不同色度，表示黑眼圈的深浅程度，数字越大，黑眼圈越严重。[1 代表浅乳白色，2 代表乳白色，3 代表浅棕黄色，4代表棕黄色，5 代表浅黄棕色，6 代表黄棕色，7 代表浅黄褐色，8 代表黄褐色，9 代表浅黑褐色，10 代表黑褐色。

2、眼袋面积的测量工具为精度±0.10mm的游标卡尺，主要测量部位为长(平行于水平线测量数据 )× 宽 ( 垂直于水平线测量数据 )

3、眼周血流量测量方法 ：选取受试者眼睑皮肤为观察部位，测试前 30min 受试者无剧烈活动。测试时局部 75％乙醇消毒，使用双通道激光多普勒血流仪的皮肤表面探头测试各眼睑皮肤表面微血管血流灌注量。

根据测试标准等级划分，患者左右眼部四周，色度均属于10级。

测试结果：

左眼：重组水蛭素凝胶（40000atu/kg).

右眼：马应龙眼霜（市售）.

结果显示，重组水蛭素改善眼部微循环显效较快，持续效用高，同类比较优势明显；试验发现：重组水蛭与素珍珠粉2.0%复配使用，效果具有增效作用。

2.抑制瘢痕增生

瘢痕增生，其本质是成纤维细胞(fibroblast，FB)的异常增殖和细胞外基质的过度沉积，是真皮损伤后局部结缔组织增生而形成的病理结构，它是创伤并发症。

现代细胞生物学和分子生物学研究认为，成纤维细胞源于胚胎时期的中胚层间充质细胞，是产生瘢痕的主要细胞。增生性瘢痕( hypertrophicscar，HS) 是创伤后常见的一种病理性愈合现象，其本质是成纤维细胞( fibroblast，FB) 的异常增殖和细胞外基质的过度沉积，并且其有一定的血管依赖性；成纤维细胞的大量增殖与凋亡抑制，细胞外基质中胶原合成与降解失衡，部分细胞因子的大量产生构成了瘢痕增生的生物学基础。

水蛭素具有抑制器官纤维化、抗炎等作用。研究发现水蛭素可能通过减少胶原产生来抑制瘢痕增生，而减少胶原产生则是通过直接抑制HSFB 的Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA 的表达来实现的

水蛭素可抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激

实验观察水蛭素对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞的抑制作用：体外培养HSFb，在DMEM培养液中分别加入1、10、50atu／L水蛭素溶液，设定为相应浓度组，每组6孔；设常规培养为对照组。于培养后24、48、72h检测各组细胞抑制率，测定细胞分泌TGF—β1水平，以及细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达。

以上结果结论10、50kU／L水蛭素溶液对HSFb增殖具有抑制作用，同时存在浓度梯度正向抑制关系。

采用含增生性瘢痕成纤维细胞的胶原网络系统（FPCL），评价瘢痕增生抑制能力。

FPCL的收缩过程，类似于人类皮肤伤口愈合中，从肉芽组织收缩到瘢痕成熟这一过程。FPCL的收缩是由成纤维细胞肌动蛋白通过纤维连接蛋白附着在细胞外胶原纤维上产生的。成纤维细胞可通过自身收缩牵引胶原，使FPCL体积缩小，胶原对这种牵引力也有对抗力，当此两力达到平衡时，胶原体积不再缩小。

各组72h HSFB Col1A2 m RNA、Col3A1 m RNA表达（取平均值）

水蛭素作用FPCL72h后，各组的Col1A2、Col3A1的m RNA表达均出现了变化，10、50U/ml水蛭素组的Col1A2、Col3A1 m RNA表达降低明显。

结论显示，重组水蛭素对瘢痕增生有医学治疗作用，修复有效添加量在50000atu/kg。

3.吸收特点

水蛭素特殊分子结构能够直接自主迅速渗透到皮肤深层，降低血液粘度、加快血流速度、改善面部微循环，维持正常的新陈代谢，并有消炎和消肿的作用，对粉刺、痤疮及细腻皮肤、收缩毛孔具有独特的效果，且无刺激、无毒副作用。

试验显示，水蛭素可渗透进入完整皮肤组织, 其凝胶剂皮肤局部涂用无明显刺激产生。

通过制备天然水蛭素凝胶,采用改良的Franz扩散池进行经皮渗透试验,使用Markwardt法检测水蛭素活性。选择健康Wistar大鼠进行急性皮肤毒性试验、单次及多次给药皮肤刺激性试验,健康豚鼠进行皮肤致敏性试验。

结果：试验组的纤维蛋白原凝结时间均有延迟,于2h时达最大值,而对照组纤维蛋白原凝结时间则无明显延迟；

结合其它护肤品使用，除发挥水蛭素功效外，可以促进其它护肤品中的营养成分更好地渗入到皮肤深层而被吸收。