【课程讲义】毛勇进：化妆品与微生物（防腐大课题），理论+实战硬技术交流！

2016.11.07

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化妆品与微生物（配方研发阶段）

课程讲义

主讲人：毛勇进博士

一、微生物的基础知识

二、产品微生物超标的不良影响

三、防腐剂的使用现状

四、防腐体系的筛选和优化

一、微生物的基础知识

今天交流的题目是化妆品与微生物（配方研发阶段），重点在于交流一下思路，而不是具体的防腐体系和相应的法规。内容分四部分，第一部分：微生物的基础知识；第二部分：产品微生物超标的不良影响；第三部分：防腐剂的使用现状；第四部分：防腐体系筛选和优化。

微生物防控是贯穿化妆品研发、生产的主线之一，要防控微生物，就要对微生物进行了解，做到“知己知彼，百战不殆”。

什么是微生物？微生物顾名思义就是人肉眼看不见的，非常微小的生物体，当然，这是一个很不严紧的定义，微生物大小一般是以微米计的，通常在1-10微米的数量级。大家最熟知的大肠杆菌为例，大肠杆菌直径大约0.5微米，长约1-3微米。支原体菌体细胞大小约为0.2-0.3μm，很少超过1.0μm。目前最大的微生物则是在1997年时，在那米比亚海岸的海洋沉淀土中发现呈球状的细菌直径大小约为100~750μm。

大家可能对微生物到底有多大没有一个直观的概念，我还是以大肠杆菌为例，1个大肠杆菌在人体上，犹如1棵树在地球上。

千奇百怪的微生物当然也能在各种环境中生存，森林、小溪、湖泊、海水、火山口、海底热泉、土壤、雪山、沙漠、大气层等等你能想到的各种各样的环境。在这里，我想到了我学生时代的一个课题ssh10b蛋白，该蛋白来源于一种极端嗜热菌，该菌的最适生长温度为110度，也就是说高压锅里沸腾的水对它来说刚刚好，你们能想象一下吗？

那么多种类的微生物，是怎么来划分的呢？

总的来说，分三型。三型包括非细胞型微生物、原核细胞型微生物、真核细胞型微生物。

非细胞型微生物其特点是无细胞结构，结构简单；由单一核酸（DNA或RNA）和蛋白质外壳组成；必须寄生在活的易感细胞内生长繁殖。其类别为病毒。

原核细胞型微生物，其特点是仅有原始核，无核膜，无核仁，染色体仅为单个裸露DNA分子；缺乏完整的细胞器。其类别分为古生菌和细菌

真核细胞型微生物其特点是细胞核分化程度较高，有典型的核结构（有核膜、核仁、多个染色体，由DNA和组蛋白组成）；通过有丝分裂进行繁殖；胞浆内有多种完整的细胞器。其类别包括真菌这个大类。

上面，我们已经讲了微生物的分类。我们再讲讲微生物的一些共性。

微生物有以下一些共性：体积小,面积大；吸收多,转化快；生长旺,繁殖快；适应强,易变异；分布广,种类多。

体积小,面积大讲得是相同质量的生物量拥有更大的体表面积。如大肠杆菌比表面积（㎡/g）可达 30 万。这对于微生物与环境的物质、能量和信息的交换极为有利。这种特性就导致了微生物吸收多,转化快；生长旺,繁殖快的特点。那么微生物生长到底有多快呢？在最适生长条件下，大肠杆菌每20分钟就可以繁殖一代。经过10小时这样的生长，就可以增殖2的30次方，即10亿7千万倍。快速繁殖会带来各方面的好处，使其能更快的适应环境。目前已确定的微生物种数在十万种左右，但仍正以每年发现几百至上千个新种的趋势在增加。微生物生态学家较为一致地认为，目前已知的已分离培养的微生物种类可能还不足自然界存在的微生物总数的 1 ％。情形可能确实如此。微生物在自然界中，除了 “ 明火 ” 、火山喷发中心区和人为的无菌环境外，到处都有分布，上至几十千米外的高空，下至地表下几百米的深处，海洋上万米的水底层，土壤、水域、空气，动植物和人类体内外，都已分布有各种不同的微生物。即使是同一地点同一环境，在不同的季节，如夏季和冬季，微生物的数量、种类、活性、生物链成员的组成等等有明显的不同。显示了微生物生态分布的多样性。

任何生物都存在生长的问题，微生物生长是指由于细胞成分的增加导致微生物个体大小、群体数量或两者的增长。当微生物在一个封闭系统内生长，一般会经历4个时期：延滞期、对数期、稳定期、死亡期。什么是封闭系统呢，举个简单的例子，一瓶保湿水长菌了，如果瓶盖密闭，那么对里面的微生物来说，这瓶保湿水的内部空间即是一个封闭体系。在封闭体系内，微生物是不可能无限生长的。

微生物受环境的影响

1、湿度、渗透压和水活度

想必大家都有这样的体验，潮湿的环境细菌生长会快很多。空气湿度对暴露在空气中细菌生长有很大的影响。许多菌（特别是霉菌）只有空气湿度达到一定的范围才有生长，过于干燥的大气将导致许多菌不能生长或失水死亡。

细胞膜是一层选择透过性质膜，所以在溶液中，渗透压大小对微生物有很大的影响。细胞被置于低渗溶液中，将吸水膨胀，若无控制，细胞会胀破。细胞被置于高渗溶液中，水渗出，若无控制，细胞会脱水死亡。有嗜盐菌可以在饱和氯化钠溶液中生长。另外，微生物学家常用水活度来定量表示水的可利用性。数值越高，说明可利用的水越多。如纯水为1，面包为0.95，盐腌鱼为0.75，蜂蜜为0.6。微生物只有能从环境中夺取水分，才能生存。如果细胞生活的基质水活度太低，细菌将不能生存。通过水活度，就很能说明为什么面包很容易长菌，而盐腌鱼、蜂蜜容易保存。

2、pH

每种微生物都有一定的生长pH范围和最适pH，超出了这个范围，微生物就将停止生长或死亡。根据所适应的pH划分，可分为嗜酸菌、嗜中性菌、嗜碱菌。

3、温度

由于微生物通常是单细胞型生物，他们的温度随环境变化而变化，所以他们对温度变化特别敏感。温度对微生物生长的一个决定性因素是微生物酶催化活动对温度的敏感性。大家都知道，绝大多数的生命活动的具体承担者是酶。酶反应和一般化学反应一样，温度升10度，反应速度加倍。所以，在低温条件内，温度升高可加快生长速度。当温度升高到一定程度时，各种蛋白、酶会发生热变性，质膜也会熔化崩解，这时微生物的生长速度就会下降。如果温度太低，细胞膜会冻结，酶也不能工作，微生物不能生长。不同微生物之间的基本温度差别很大。根据这些温度的不同，可将微生物分为嗜冷菌、兼性嗜冷菌、嗜温菌、嗜热菌、超嗜热菌。

4、氧浓度

不同的微生物对氧气的需求是不一样的，对一些微生物来说氧气的必需的，可是对另外一些微生物，氧气就是毒药。根据对氧气的需求程度，可将微生物分为专性需氧菌、兼性厌氧菌、耐氧厌氧菌、专性厌氧菌和微需氧菌。

5、压力

大多数微生物在陆地或水体表面生活，这些地方大气压为1，气压对这些生物没有明显影响。可是在深海中，那里的压力可以达到600-1100大气压，在这种地方只有少数的耐压生物可以生存。

6、辐射

我们生活的这个世界充斥着各种各样的电磁辐射。许多电磁辐射对微生物特别有害，特别波长短、能量高的电离辐射。如x射线、伽马射线，可以用来消毒。这里还要单独讲一下紫外线。紫外线（10-400nm）经常用来进行表面消毒。波长260nm的紫外线具有极强的杀菌能力，除了上面所说的波长短、能量高，还有另外一个重要的原因： 260nm波长的紫外线最容易被DNA吸收，导致DNA一条单链上胸腺嘧啶形成2聚体，从而抑制DNA复制及其功能。

对于化妆品配方工程师而言，很有可能会碰到产品长菌的现象。我的产品已经加了防腐剂了，为什么还会长菌呢？产品长菌，最主要的原因是耐药菌的产生。当微生物长期暴露在某种杀菌剂或防腐剂下，慢慢地就会产生相应的抗药性。抗药性并不是由直接暴露于某种药物而产生的，而是自发产生的突变株随后选择而存活下来。举个例子，比如说某菌暴露在的卡松中，菌本身会产生突变，不定向的突变，其中恰恰有一个突变株是能够适应该卡松的，就存活了下来，该菌株也就带有了对卡松的抗药性。

微生物产生抗药性后，其携带的抗性质粒可以通过正常的基因交换过程，如接合、转化和转导而相当迅速的转移到其它细胞。这种交换的存在，大大加速了耐药菌、甚至是具有多种抗性的超级菌的产生。

二、产品微生物超标的不良影响

我们先来看一下新颁布的2015版《化妆品安全技术规范》中有关微生物学指标的要求。里面是这么写的：菌落总数，眼部化妆品、口唇化妆品和儿童化妆品不超过500；其他化妆品不超过1000。霉菌和酵母菌总数不超过100。耐热大肠菌群、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均不得检出。

我们再来看看世界其他地区对化妆品微生物的要求，从上图可以看到这些指标基本相同，除了美国规定的细菌总数不得超过500，有所差异。以上是国家给的标准，那么一般工厂的实际内控指标又是怎样的呢？正常情况是所有菌都不得检出吧，哪怕检出一个微生物，也是要尽快进行复检，看一下是环境污染还是产品确实有菌；若产品确实染菌，那微生物数量是增加呢还是减少？或是不增不减？从而采取相应的后续措施。

微生物复检结果

若复检，微生物数量增加，说明该产品的防腐体系已经崩溃或失效，那么可以预计，若不采取措施，微生物数量将持续增加，直到进入第一部分所讲的稳定期。

若复检，微生物数量减少，说明产品的防腐体系依然在起作用，这些微生物是由原料或环境中带入的。由于这些微生物的进入，会削弱原有的防腐体系。

若复检，微生物数量持平，这种情况较少出现，但也不是没有。比如，某原料中有某芽孢杆菌的芽孢，生产中加入该原料就会将芽孢带入产品中。芽孢是细菌的休眠体，能够抵御外界诸多不良环境。由于产品中防腐体系的存在，对于芽孢来说是一个不良环境，继续保持休眠，不会繁殖，但由于检测时由于培养基的加入，又能给检测出来。

若产品微生物超标，将带来各方面的不良影响，我会从以下三方面进行讲述：微生物超标对产品本身的影响，微生物超标产品对人体的影响，微生物超标产品对企业的影响。

微生物超标会对产品本身产生什么样的不良影响呢？产生臭味、变色、粘度变化、pH变化、相分离、包装坍塌膨胀甚至炸开、明显可见的微生物生长，这些变化，大家应该是能够很快想到的。微生物超标带来产品成分的变化，可能会被忽略。产品成分的变化分为两大方面，一方面是微生物生长，将产品中的某些成分作为营养物质进行消耗；另一方面是微生物代谢产物以及微生物本身对产品成分的改变。另外，有些时候微生物会大量稳定存在于产品中而没有明显迹象。

使用微生物超标产品会对人体产生什么样的不良影响呢？主要有三方面的不良影响：一、对皮肤造成损害，造成刺激、过敏等不良反应；二、某些致病菌可能会引起疾病；三、微生物代谢产物会影响人体的健康。

下面，我们谈谈微生物超标产品对企业的影响。一旦有产品微生物严重超标了，就非常难处理了，往往只能作报废处理，这就会给公司带来严重的经济损失。而正常的生产很可能将被打乱，在找出原因之前，至少同一条生产线是不敢轻易再生产产品的。若微生物超标产品不幸流入到市场上，就需要将其召回，同时面临其他重大风险，比如质量抽查、消费者投诉、新闻曝光对企业信誉的影响等等。

三、防腐剂的使用现状

要确保产品的微生物安全性，可以在三大环节进行微生物风险控制：原料、产品设计、生产卫生。产品设计环节又可细分为配方、工艺、包装、消费者使用等四个方面。比如工艺采取的是冷配还是热配、加原料的顺序及其温度等。包装中采用的是什么包装，一次性的还是反复使用的，广口的还是小口地或者泵头的等等。消费者使用产品的习惯、放置环境等等。

但正如本讲座的题目一样，我们仅对配方方面的微生物风险控制进行详细的讲解。配方设计微生物风险控制方面要考虑多方面的问题，比如pH值，水活度，成份等等，但防腐剂的选择无疑是重中之重。

对于化妆品，防腐剂存在两面性，一、防腐剂可以保护产品在生命周期中的微生物安全；二、防腐剂也是带来刺激、过敏的主要原因之一。所以，防腐剂的使用要适度，而这个度非常难掌握。既然要讲度，就会涉及到测量问题，没有测量哪来的度呢？

防腐剂的选择

防腐剂的选择，配方工程师往往会从有效性、稳定性、和其他成分的相容性、对皮肤刺激性、致敏性、法规、公共事件、成本等方面考虑。

有效性主要是看防腐剂的MIC值等反映杀菌抑菌效果的数据和使用条件等，不同的防腐剂有不同的抗菌谱，所以防腐剂经常复配使用。比如，有机酸类的防腐剂在酸的形式下才能发挥防腐作用，所以体系的PH值就影响很大了。在下面，我还收集了一些常见防腐剂MIC值，供大家参考。

稳定性要考虑防腐剂本身的稳定性以及温度、pH对其的稳定性的影响。比如卡松使用时，尽量避免温度超过55℃和pH大于8.5。IPBC在碱性pH范围的配方是不稳定的。

和其他成分的相容性，主要要考虑溶解度、配伍性等，比如，阴离子表活和阳离子防腐剂的不配伍，对羟基苯甲酸乙酯、丙酯在水中溶解度不好。

随着消费者对化妆品安全的越来越关注，防腐剂对皮肤的刺激性、致敏性是配方工程师非常看重的方面。

法规对防腐剂的使用也有巨大的影响，比如2015版的化妆品安全技术规范就对MIT、CMIT的使用影响巨大。

公共事件、社会舆论，对防腐剂的使用也会产生很大的影响，比如甲醛释放体类的防腐剂就已经被越来越多的企业所规避。

成本当然也是要考虑的，不同类型的产品、不同价格层次的产品，所选的防腐体系必然有所不同，防腐体系的成本可以从几分钱一公斤到几块钱一公斤不等。

常见防腐剂的MIC值

这是我收集的常见防腐剂的MIC值，这里面，除了卡松是复配的，其他都是单一防腐剂。由于测试细节的不同，相同防腐剂不同厂家的MIC值会略有差异，该表仅供大家参考。从表上，可以看到卡松的极其高效。苯甲醇和苯氧乙醇的性能基本一致，抗菌谱也很均衡。3-碘-2-丙炔基丁基甲氨酸酯简直是少有的抗真菌神器。现在用的越来越多的乙基己基甘油的MIC值很均衡，效率也很高，可以宣称无添加，唯一要考虑的是如何在水相中提高溶解度。

除了上面所讲的几个方面，我这里还要额外的讲一讲可能会被忽略的几个地方。

1、油水分配。防腐体系的选择一定要考虑防腐剂的油水分配问题。举个例子，苯氧乙醇在25度水中的溶解度为2.6g/100g，在棕榈酸异丙酯-水体系中的分配系数为2.9。如果在棕榈酸异丙酯-水1：1体系中，加入1%的苯氧乙醇，那么经计算，苯氧乙醇在水中的浓度为0.51%，在棕榈酸异丙酯中的浓度为1.49%。对羟基苯甲酸甲酯25度在水中的溶解度为0.25g/100g，乙酯为0.17、丙酯为0.05，他们在许多油相中溶解度会好的多。苯氧乙醇和对羟基苯甲酸酯互配是一个应用非常广的防腐体系，但如果遇到大量的油脂体系，特别是该油相对苯氧乙醇和对羟基苯甲酸酯有很好溶解度时，该体系的防腐效能会大大降低。我手头的实验数据很好的证明了这一点。在许多防晒产品中，加入苯氧乙醇和对羟基苯甲酸酯互配的防腐体系，并不能通过防腐挑战，相对同样的剂量在水剂产品中防腐效能大大降低了。如果补加水溶性的防腐剂，问题就可以得到解决。若加入溶剂，能够提高水相中防腐剂的浓度，也是能够提高防腐体系效能的。比如丙二醇对对羟基苯甲酸酯防腐剂有很好的增效作用，可能就是基于丙二醇的加入可以提高对对羟基苯甲酸酯在水相的溶解度有关。

2、胶束的影响。大家都知道胶束有增溶的作用，比如可以增溶香精等，其实，胶束同样可以增溶许多防腐剂。那么如果将胶束看作一个相，水相看作一个相，是不是跟油水分配问题很像呀。所以，胶束同样会带来某些防腐体系效能的下降。这一点，在我做洁面类的产品时得到验证。拓展一下，对氯间二甲苯酚（PCMX）是做抗菌、抑菌洗手液、洗衣液时常用到的杀菌剂，他在水中的溶解度极低，只有0.03，如果工程师没有认识到胶束对PCMX的增溶作用导致杀菌效率的下降的话，很有可能在最后的配方中加入大量的PCMX而得不到想要的结果。

3、卡波体系。有文献报道卡波和透明质酸钠一样，能够降低滴眼液中防腐剂的不良反应，这个正常的一个推论就是卡波对防腐效能有削弱作用，我的实验也应证了这点，所以，以卡波为增稠体系的啫喱产品尤其要注意其防腐体系。

4、固体表面特异性吸附。在一些产品中，存在固液界面，比如BB霜、CC霜、防晒霜、面膜等，这些产品中存在的固体部分表面，比如二氧化钛、颜料、面膜布等，可能存在特异性吸附。我朋友曾经测过消毒丝巾中杀菌剂的浓度，发现理论浓度和实际浓度存在较大差异，他的推测就是发生了特异性吸附。现已发现某些化妆品颜料，如群青蓝类、红色氧化铁、黄色氧化铁吸附羟苯甲酯、羟苯丙酯。

5、营养物质的影响。在许多配方中，都会加入蛋白质、多糖等有机营养物质，这些物质的加入，通常会导致防腐体系效能的下降。在消毒技术规范中的消毒剂消毒与灭菌效果验证实验中是要专门加入有机干扰物牛血清白蛋白的，已保证这些消毒剂能在有机干扰物的干扰下，还能发挥一定的消毒和灭菌效果。可见有机营养物质对防腐剂、杀菌剂的效能肯定是有削弱的。

6、防腐增效物的影响。在许多配方中，其实有很多防腐增效剂的存在。乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）可螯合金属离子，影响微生物的代谢，从而增强防腐剂的效果，并有抗氧化作用。丙二醇可增强尼泊金酯类的防腐活性。某些香精如丁香酚、香叶醇、薄荷醇等萜类化合物有抗菌特性，可减少防腐剂用量。乙醇含量超过10%可增加防腐效果，其含量在15%以上，甘油含量在40%以上都可防腐。由于这些物质的存在，其实可以大大减少防腐剂的添加量。我给大家举个极端的例子，护发素产品常常添加有大量的阳离子表活、阳离子聚合物，我曾经看了公司的护发素产品之后，和配方工程师说，你打个样，不要加防腐剂，送去做防腐挑战实验看看，结果证实我的推测，顺利的通过了防腐挑战测试。

关键点——水相防腐

这里，我要和大家说一下防腐体系要成功的关键，那就是做好水相的防腐。原因很简单，微生物生长需要水，所以能生长、繁殖的微生物只能存在于水相以及油水界面处。但，由于法规及舆论的压力，好用的便宜的水溶性好的防腐剂已经越来越少了，比如卡松、MIT、DMDMH等都面临挺多问题的。戊二醇、己二醇等水溶性好，但要达到相同的性能，价格乘10倍都不止。

上面讲了选择防腐体系要注意的地方，那么，怎样的防腐体系是好的防腐体系呢？我认为做到以下几点，就可称得上好的防腐体系：一、在体系中稳定、有效；二、温和、低刺激、低致敏；三、成本低；四、法规、公共事件风险低。

对于防腐体系的使用现状，我大致将所使用的防腐体系分为三个阶段，当然，这三个阶段不是完全有序和分开的。

第一阶段，淋洗产品普遍使用卡松、DMDMH等防腐剂，驻留型产品则普遍使用MIT、DMDMH、咪唑烷基脲、双(羟甲基)咪唑烷基脲、IPBC。这一阶段的防腐体系的特点是便宜、好用。卡松、MIT、DMDMH、双(羟甲基)咪唑烷基脲的水溶性极好还便宜，IPBC对真菌效果极佳。但问题也很多，卡松、MIT的刺激性和致敏性，DMDMH、双(羟甲基)咪唑烷基脲则是甲醛释放体，IPBC则不得在三岁以下儿童产品中使用。

第二阶段，为了提高产品的安全性，已经有厂家开始使用苯氧乙醇、苯甲酸钠、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯等相对温和的防腐剂了。驻留型产品基本都进入该阶段了，淋洗型产品则大多还在第一阶段，部分产品使用第二阶段的防腐剂。

有些公司已经进入第三阶段，采用乙基己基甘油、二醇类、有机酸、单辛酸甘油酯等更安全温和的防腐剂替代物了。这些目前主要是在儿童产品、高端产品上用的较多。

配方工程师打样时，更多的是关注产品的保湿、粘腻、铺展、外观、香气等等可以通过自身比较容易感知的特性，防腐体系的选择更多地是依靠以下经验：1、行业通行的一些经验；2、防腐剂原料商的推荐；3、所在公司的常用防腐体系；4、自身的一些使用习惯。以上种种情况均存在重大缺陷，即靠配方工程师自身无法判断该防腐体系的刺激性过敏性怎么样、添加量合不合适，为了保证产品不出微生物质量问题，往往防腐剂添加量都较大，有时接近法规的上限。这是因为他没有拿到量化的有关刺激性过敏性的报告、有关防腐效能的报告。如果该企业没有这两个功能块，那么配方工程师想对配方防腐体系优化就比较困难了。但也不是不可能，可以委托第三方检测机构进行，但费用高、时效性差，很少企业会采用这种方式。

在这一块，我有大量的实验证实，许多护肤品配方添加了超过自身所需的过量的防腐剂。

不同配方间差别极大，在防腐能力方面也是差别极大的。我就测试过许多对照样（没有加防腐剂），发现有一些对照样也是有很好的防腐能力的。对于这种体系，你还需要加大量的防腐剂来保证它的微生物安全吗？

在这部分的最后，我分享下2年前做的一个工作。我购买了宝洁、欧莱雅、资生堂三个国际大公司的超市渠道的产品，对其防腐体系进行了分析测试，具体测试数据就不说了。你们会从上表发现个问题，就是不同的公司，防腐体系是相对稳定的。宝洁以苯甲醇与尼泊金酯互配的防腐体系为主，欧莱雅、资生堂以苯氧乙醇为主，互配其他防腐剂。大家可以参考一下。

你们再想想，你们公司或个人是否也有防腐剂的使用倾向。

四、防腐体系的筛选和优化

益处

如果一个化妆品企业建立了相关的测试平台，对化妆品防腐体系进行筛选和优化，那么将给该企业带来如下明显的益处：

1、确保产品在生命周期中微生物安全。我认为，对于一个化妆品配方而言，通过微生物防腐挑战实验是基本要求。

2、节约成本、减少产品刺激性和过敏率。成本节约能够直接产生利润。减少产品刺激性和过敏率，可以减少客户投诉，提高产品口碑。

3、增强企业应对防腐剂带来的法规风险和公共事件风险。如果企业具备以上的能力，那么他们就能相对自如的切换产品的防腐体系。

三大平台

防腐体系筛选和优化可能会涉及到的三大平台：仪器测试的防腐剂部分、产品测试的安全性测试部分、微生物防腐挑战实验。三大平台中，以微生物防腐挑战实验为主，其它两个平台为辅。

每个平台，独立使用可以解决各自的部分问题，配合使用将大大提升公司筛选和优化防腐体系的能力。下面，我会简要介绍仪器测试的防腐剂部分、产品测试的安全性测试部分，重点介绍微生物防腐挑战实验。

仪器测试的防腐剂部分目标很简单，就是测试防腐剂的种类和含量，主要用到的仪器为HPLC、GC-MS。那怎么去用呢，第一，你可以跟我上面介绍的工作一样，测试分析竞品的防腐体系，起到参考的作用，他山之石可以攻玉。第二，可以分析稳定性实验前后的防腐剂含量的差异，可以非常客观的衡量该防腐体系在产品中的稳定性。第三，可以帮助查找微生物超标的原因和寻找对策。举几个例子。曾经有公司某产品单批次微生物超标，用仪器测试防腐剂含量，发现该防腐剂含量明显偏低，一个可能的原因是防腐剂少加了，后来排查的结果也证实了该推测。若某产品微生物超标，但经仪器测试发现防腐剂含量正常，那么基本可以肯定生产环境没有控制好，产生耐药菌了。

产品测试的安全性测试部分可能会使用到的实验有动物皮肤刺激性或腐蚀性试验、斑贴实验、鸡胚绒毛尿囊膜实验、细胞毒性实验、3D皮肤模型、消费者试用。通过这些实验，可以给出被测试防腐体系的安全性数据，在筛选和比较不同种类的防腐体系时，特别有用。比如，你们可以通过上面所说的实验比较MTI体系和苯氧乙醇、对羟基苯甲酸酯互配体系的安全性。

动物皮肤刺激性或腐蚀性试验，大家参照2015版的《化妆品安全技术规范》，不过这个实验我认为对于企业基本没有作用。一、企业本身很难去自己做动物实验，二、该实验灵敏度极差，你们有没有听说过哪个产品通不过该实验的。如果真通不过，那只能说该产品刺激性不是一般的大。

斑贴实验，大家可以参照2015版的《化妆品安全技术规范》里人体皮肤斑贴试验，不过，以我的经验来说，斑贴实验的灵敏度也不够。

鸡胚绒毛尿囊膜实验是一个容易建立、实施同时花费较少的实验，很不错，现在有挺多公司用这个实验来测试原料或产品的刺激性。但，毕竟鸡和人存在巨大的物种差异，所以实验结果参考意义比较大。

细胞毒性实验根据实验细胞株的不同分为3T3（小鼠成纤维细胞）中性红吸收细胞毒性实验、正常人角质细胞中性红吸收细胞毒性实验。具体实验方法参见程树军博士撰写的《实验动物替代方法原理与应用》。我认为正常人角质细胞中性红吸收细胞毒性实验的实验结果更具参考价值，毕竟没有物种差异。中性红吸收细胞毒性实验也有其缺陷，不好溶解的物质不好测试，而且化妆品在实际使用过程中存在角质层的阻隔，细胞实验不能模拟这一点。

3D皮肤模型的安全性测试已经比较成熟，目前国内可用斯安肤诺公司提供的EPISKIN 3D皮肤模型进行，不过前提条件是公司拥有细胞实验室。也可以让第三方检测机构SGS进行测试，不过费用就相对较高了。3D皮肤模型已经和人体皮肤结构非常像了，是以后做化妆品各种测试的理想实验对象。

消费者试用。这个要有足够的样本量才能保证数据有统计学上的意义。实验的过程控制也非常重要。这里提示一句：如果你做水剂产品安全性测试，可以灌成面膜形式，再进行实验，这样会提高实验的灵敏度，对比较多个样品的刺激或过敏，有非常好的效果。

企业可以根据自己的实际情况建立1个或多个实验方法，也可以委外检测。

化妆品微生物防腐挑战实验并没有一个统一的实验方法或标准，主要执行的方法有CTFA（美国化妆品、盥洗品和芳香品协会）、ASTM（美国检验方法及材料协会）、USP（美国药典）。这些方法的实验过程基本大同小异，通过的标准则有所不同。由于时间的关系，我只介绍CTFA的方法。CTFA现在已经更名为PCPC了。实验流程分5步：1、选取具有代表性的菌种；2、斜面培养各菌种；3、洗下菌体，配成所需浓度的菌液；4、与样品按比例混合，搅拌均匀，在指定温度下培养；5、接种后0、1、3、7、14和28天分离检测微生物数量。通过标准：在第7天时，细菌降低99．9％，霉菌和酵母菌各降低90％，并且在28天内持续下降。

菌种的选择可参照该表。据我所知，广东省微生物所默认的测试菌种是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色假丝酵母、黑曲霉。当然，也可以按需增加菌种数量。我以前给前东家们建微生物防腐挑战实验时，也是选的这几种。防腐剂公司测防腐剂的MIC值时，往往也是选这几种做实样的。

生物防腐挑战实验按接种次数可分为单次微生物防腐挑战实验、多次微生物防腐挑战实验。有少数企业采用的是多次微生物防腐挑战实验，对此我很不赞同。为什么呢？多次微生物防腐挑战实验看似更加严格，但实际他违反了前面讲的防腐剂使用要适度的原则。记住：你是在开发化妆品，不是在开发消毒产品。同时，不要指望产品防腐体系解决所有微生物问题，原料控制和生产卫生控制同样很重要。

防腐体系的筛选和优化可以在2个维度进行，一个维度是种类的选择和互配；另一个维度是浓度的筛选。

下面，我会将两个实例给大家。

这是一个水剂产品防腐体系的筛选实验。第一阶段，选用A、B两种防腐剂互配，总浓度控制在1%，设置了如上图的5个比例：第一个是A0B1、第二个是A0.25B0.75、第三个是A0.5B0.5、第四个是A0.75B0.25、第五个是A1B0。

大家从图上可以看到，5个组合的防腐效果都很不错，除A0B1组合外，其他组合均在第7天全部杀灭微生物。鉴于防腐剂互配，且尽量少使用B的原则，我们决定将A0.5B0.5、A0.75B0.25的组合继续细化，进行第二阶段的实验。

第二阶段实验思路是选用A：B=1：1；A：B=3：1的组合，但总浓度不再控制在1%。，而是0.8%、0.6%、0.4%。实验结果如下

从实验结果来看，总浓度低至0.4%也是可以通过防腐挑战实验的。通过这个实验，在实际使用过程中，我们不就可以减少加腐剂添加量了吗？

无添加已经成为一个趋势，无防腐剂添加应该是里面最重要也相对合理的（我对一些无添加是持保留意见的，比如无硅油、无酒精等）。

提到无防腐剂添加的体系，配方工程师首先想到的是高额的成本。那能不能通过优化，来降低成本呢？

我目前手头正在进行这样的项目，我采用2种防腐剂替代物进行互配，其中一种是己二醇。按照己二醇的防腐性能，2%是一个很正常的添加量。但我根据我体系的特点，认为可能有优化的空间，所以做了对己二醇浓度的筛选，采用了己二醇4个浓度梯度：2、1.5、1、0.5。目前的结果是低至0.5%己二醇的添加量与另外的防腐剂替代物互配，也能很好的通过微生物防腐挑战实验。下一阶段的实验还在进行中，说不定有更多的惊喜。仅从目前的结果来看，己二醇从2%降低到0.5%，己二醇以400元/公斤计算，成本降低6元。该配方的防腐成本已经被控制在3元以内，还可以继续优化。

有工程师会说，你上面所说的三大平台，我司一个都没有。也有工程师会说，开发时间那么紧，哪有时间做防腐挑战实验，更别提筛选和优化了。其实，今天的交流，主要是交流思路，让大家意识到防腐剂可以这样去筛选和优化，可以带来诸多的好处。有意识，才可能有后面的行动，逐步去实现。另外，我上面的各种测试，真想做的话，都有检测机构帮你实现的。

精耕细作，提高国产化妆品的质量和内在科技含量，是我们每一个研发人员的责任所在，希望大家一起努力！