【干货】芦荟提取液中芦荟多糖提取、分离及纯化的方法

2016.08.02

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芦荟为百合科芦荟,属多年生常绿草本植物，目前世界上已明确分类的有500种以上。。研究发现，芦荟富含多种生物活性物质，广泛应用于食品、美容、保健、医药等领域。芦荟提取液中有效成分有芦荟多糖、芦荟甙、芦荟大黄素、芦荟大黄酸，其中，芦荟多糖是芦荟凝胶中的主要生物活性成分，具有抗癌、抗辐射、抗衰老、抑菌消炎、提高免疫力等药理作用。今天找原料君给大家详细讲讲芦荟多糖的提取、分离以及纯化。

芦荟多糖的提取

传统方法与辅助提取方法

传统的提取芦荟粗多糖的方法有水提取法、酸提取法、碱提取法、酶提取法等，其中最为普遍的是水提醇沉法。丁晨等采用此种方法提取中华芦荟粗多糖，确定最佳提取工艺为料液比1：10 g/ml，提取2次，提取时间3h。

传统提取方法具有耗时长、产率低的缺点，因此常用其他方法对其辅助提取，主要有微波辅助提取法和超声波辅助提取法。

微波辅助提取法是通过微波热效应及产生的电磁波效应，加快分子的运动，迅速释放多糖。超声波辅助提取法是利用超声波的空化作用，使原料细胞壁易于破碎，有助于多糖的溶出。

分别用传统热水浸提、超声波辅助和微波辅助提取方法研究库拉索芦荟粗多糖的提取条件，得出了三种方法的最佳提取条件对应的提取率分别是5.17%、5.42%、5.22%，而且后两种方法大大缩短了提取时间。

芦荟多糖的提取

新型提取方法

新型提取方法主要有超临界流体萃取法和双水相萃取法。

超临界流体萃取技术是利用CO2等在超临界状态下特殊的性质，将其与待分离的物质接触，使其有选择性地依次把极性大小、沸点高低和相对分子质量大小不同的成分萃取出来。具有提取效率高、操作温度低、能耗少、无污染等优点，已广泛用于生物、食品、医药、化妆品等领域。朱俊玲通过超临界CO2流体萃取芦荟多糖，多糖得率是传统方法的1.5倍。超临界萃取的最佳工艺条件是乙醇用量为250Ml/100g芦荟，萃取压力为25MPa，萃取温度为35℃。

双水相萃取（ATP）技术是利用物质在两相间分配系数的不同实现分离的。与传统的液——液萃取相比，双水相体系由于两相都以水作溶剂，具有萃取条件温和、操作简单、溶剂消耗少、萃取效率高、环保等优点，已广泛应用于多种生物组织和生物物质的分离纯化。邢健敏等采用聚乙二醇/硫酸铵双水相体系从芦荟中分离出芦荟多糖，其含量高于传统的醇沉法，且减少了有机溶剂的用量。李文君等研究了芦荟多糖在温度诱导双水相体系中的分配行为，确定了双水相萃取分离芦荟多糖的最佳体系，并建立了最佳工艺条件。

芦荟多糖的分离

常用的五种方法

芦荟多糖的分离主要包括脱蛋白和去除小分子杂质等。

Sevage法

Sevage法是根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，将多糖液与一定比例的有机溶剂混合，使蛋白质沉淀，离心除去。此法比较温和，在避免多糖降解上效果较好，但效率不高，需反复多次，多糖有损失。

酶解法

酶解法即在多糖液中加入蛋白质水解酶（常用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等）将蛋白质降解，通常先用此法使蛋白质部分水解，再用Sevage法效果较好。

三氯乙酸法

三氯乙酸法是利用蛋白质与有机酸作用而变性沉淀，在多糖液中加入3%左右的三氯乙酸，加到不再继续产生沉淀为止，静置过夜，离心即得。此法除蛋白率较高，但易引起多糖的降解。

盐酸法

盐酸法是用盐酸将多糖液pH值调至3，放置过夜，离心去沉淀。此法脱蛋白率较高，但易引起多糖的降解。

三氟三氯乙烷法

三氟三氯乙烷法除蛋白效率较高，但因溶剂沸点低，不易大量应用。

粗多糖中常含有一些无机盐、单糖、低聚糖、氨基酸等小分子杂质，进一步纯化之前需去除这些杂质，常用的方法有透析、超滤等。

“芦荟多糖的功效与其结构密切相关，然而多糖结构复杂，分离纯化及分析比较困难，随着提纯、结构分析技术的不断发展及多糖功效机理研究的不断深入，芦荟多糖的探究空间和应用前景将更加广阔。”

芦荟多糖的纯化

常见的三种方法

分级沉淀法

（主要包括季铵盐沉淀法、有机溶剂分级沉淀法）

季铵盐是一类阳离子表面活性剂，可与酸性多糖形成不溶于的沉淀，而与中性多糖不生成沉淀，因此此法常用于酸性多糖的分离。

有机溶剂分级沉淀法是根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，依次按比例由小到大加入溶剂分级沉淀。崔春月用热水浸提法得到芦荟粗多糖，然后依次用50%和80%的乙醇得到了两种不同的活性多糖。

色谱分离法

色谱分离是纯化芦荟多糖最常用的方法，能有效分离多糖组分，作用温和，能较好地保存多糖的结构和生物活性。常用的方法有阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、大孔树脂柱层析、高速逆流色谱法等。

阴离子交换柱层析法适用于纯化酸性多糖、中性多糖及粘多糖，常用的交换剂有DEAE——纤维素、DEAE——葡聚糖、DEAE——琼脂糖等。多糖在不同洗脱剂作用下通过吸附与解吸附作用得到分离，同时一些蛋白质和色素等杂质被吸附于柱上端，使多糖初步纯化。

凝胶柱层析又称凝胶过滤，是将多糖按分子大小和形状不同分离开来，由于不同大小和形状的分子扩散到凝胶孔隙内的速率不同，因而通过层析柱的快慢也不同，从而实现分离。常采用葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。凝胶柱层析纯化的特点是惰性载体、吸附力弱、吸附条件温和，充分保留待分离物质的活性。一般纯化多糖时常将以上两种方法结合使用，吴广枫等对芦荟粗多糖先后用DEAE-纤维素和SephendexG-200进行了分级纯化，得到了多糖单一组分。

高速逆流色谱是一种高效的液—液分配色谱技术，不需要固相载体，特别适合天然活性成分的分离。王晓丽等研究了高速逆流色谱分离芦荟多糖的溶剂系统，成功分离出了两个多糖单一组分。

膜分离法

膜分离是在20世纪初出现，20世纪60年代后迅速崛起的一项分离纯化技术。是利用具有一定选择透过性的过滤介质，在外界能量或化学位差的推动下对多组分混合物进行物理的分离、提纯和富集。

按照膜孔径或截留分子量的不同，可分为微滤、超滤、纳滤和反渗透等；根据材料性质的不同，可分为无机膜和有机膜，无机膜主要是陶瓷膜和金属膜，有机膜由高分子材料做成，如醋酸纤维素、聚酰胺、聚醚砜等。
膜分离技术具有操作简单、常温下可进行、无二次污染、无相变、分离效率高、能耗低、不会破坏被分离物质的生物活性等优点。对于性质相似组分的分离具有独特优势，而且可与常规分离方法联合使用，但同时也存在着膜易污染、难清洗的问题。

目前关于膜分离技术应用于多糖分级纯化的研究不多，主要取得了一些探索性的进展。邢健敏将芦荟多糖水溶液通过自制的截留分子量为68000的超滤膜，工作压力为0.1MPa~0.2 MPa，溶液pH为3~4，初步确立了芦荟多糖膜分离纯化工艺。董艳首次采用超滤和纳滤技术提取纯化地黄低分子多糖，以微滤作为超滤前的预处理方法，确定了膜分离的最佳操作条件，得到的多糖纯度较高。Alain Marcati等采用截留分子量为300000Dal和10000Dal的超滤膜，通过两步膜分离从紫球藻中分别得到了纯度指数为2.3的藻红蛋白和高含量的可溶性多糖。

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